Дана Скалли родилась 23 февраля 1964 года, родители – Маргарет и Вильяма Скалли, дружное католическое семейство ирландского происхождения. У неё есть старший брат, названный в честь отца Вильямом, старшая сестра Мелисса и младший брат Чарльз (он не появляется в сериале). Отец Даны служил офицером ВМФ. Детские годы Даны проходили в Аннаполисе и Сан-Диего. Её любимой книгой был «Моби Дик».

Она получила образование в университете Мэриленда, который закончила со степенью бакалавра по физике. Дипломная работа Скалли называлась «„Парадокс близнецов“ Эйнштейна: Новая интерпретация». После окончания медицинской школы она была завербована в ФБР, причём работа в бюро ей нравилась, поскольку Скалли чувствовала, что она может отличиться на этом поприще. До того как стать напарницей Фокса Малдера, она работала как специалист по вскрытиям и судебный патолог, часто сталкиваясь со случаями и жертвами в делах, относящихся к «Секретным материалам».